中大新聞網訊（通訊員李劍峰）真核生物基因組中廣泛存在大量在染色體上串聯排列的同源基因，稱為tandemly arrayed genes或TAG。TAG在擬南芥、水稻、小麥、楊樹、玉米基因組中占比約14~35%，在人和小鼠中占比約14~17%。TAG的功能研究需要同時解決基因功能冗余和染色體連鎖兩大難題，而CRISPR技術為TAG的功能研究提供了完美的工具。理論上，僅需使用一對gRNA分別靶向TAG的頭和尾兩個基因，則可將整段攜帶TAG的染色體刪除，從而實現TAG的功能缺失。但值得注意的是，近年來在動植物中陸續發現CRISPR技術在染色體上產生的多個DNA雙鏈斷裂（DSB）會誘發染色體的異常變異，如重排、倒置等等。
近日，中山大學生命科學學院李劍峰課題組在Nature Communications發表了題為“Hidden prevalence of deletion-inversion bi-alleles in CRISPR-mediated deletions of tandemly arrayed genes in plants”的研究論文，報道了在成對的gRNA引導下，CRISPR介導的TAG敲除會引發高頻的染色體缺失/倒置雙等位變異。該雙等位突變體極易被傳統基于三引物法的基因型鑒定PCR誤判為純合缺失突變體，繼而會給后續的TAG功能研究埋下隱患。
作者首先為了研究擬南芥基因組中編碼PEP細胞因子前體（PROPEP）的典型TAG功能，設計了成對的gRNA對串聯的多個PROPEP基因進行CRISPR/Cas9敲除，并通過傳統三引物法鑒定純合缺失突變體。所謂三引物法是指先用分別結合于TAG兩側的一對相向引物進行第一次（tier-1）PCR，出現陽性的小分子量PCR條帶則說明存在染色體刪除；再用分別結合于TAG外側及內部的一對相向引物進行第二次（tier-2）PCR，無PCR條帶則說明缺失正常的TAG序列；兩次PCR的結果可共同鑒定出純合缺失突變體。然而，在對獲得的“純合缺失”突變體進行轉錄組分析時，作者意外發現位于TAG內部“已被刪除”的PROPEP基因仍在表達。結合前述PCR結果與隨后進行的TAIL-PCR和Sanger測序，最終發現一條染色體上的TAG已被刪除，而另一條同源染色體上的TAG則在兩個DSB位點之間發生了倒置，因而tier-2 PCR未能產生PCR條帶，引起對基因型的誤判。該突變體的子代中，缺失、倒置兩種基因型的分離進一步確認了親代的缺失/倒置雙等位突變形式。基于deletion和inversion兩個已有術語，該研究將此種新的雙等位突變形式命名為delinver突變。
圖1. 模式植物擬南芥中串聯同源基因的CRISPR敲除誘發意外的敲除/倒置雙等位突變體。a, 擬南芥的PROPEP基因家族是代表性的串聯同源基因。b, CRISPR敲除PROPEP1-8所用的成對gRNA靶向示意圖。c, PROPEP1在傳統三引物法PCR鑒定的“敲除”突變體propep1-8 #2-4植株中仍存在表達。d, PROPEP1應答的抗病基因在“敲除”突變體propep1-8 #2-4中仍有正常應答。e,f, 新的PCR鑒定策略揭示propep1-8 #2-4突變體是敲除/倒置雙等位突變體。
接下來，通過對擬南芥、水稻中多個不同的TAG進行成對gRNA介導的CRISPR/Cas9敲除，在近2650個轉基因植株或愈傷組織中，共有31對gRNA成功產生大片段的TAG敲除，其中有27對gRNA能夠造成delinver突變。比如，在對編碼擬南芥NLR免疫受體AT5G45240/AtRPS4/AtRRS1進行的12組TAG敲除中，某些成對gRNA所誘導的TAG敲除突變體中有高達~80%實際上是delinver突變體，12組的中位數為~51%。Delinver突變的發生與TAG所在的染色體位置、刪除片段的大小均無顯著相關性，但總體上與該對gRNA所造成的TAG刪除效率呈正相關性。此外，切割產生粘末端的CRISPR/Cpf1系統與切割產生平末端的CRISPR/Cas9系統一樣，在植物原生質體細胞中也會誘導delinver突變。進一步，作者發現成對gRNA介導的CRISPR敲除在植物基因組的非TAG位點（比如，TAG的相鄰區域或者代謝基因簇）也會產生頻率相似的delinver突變。這些結果表明，成對gRNA介導的CRISPR敲除在植物基因組上誘導delinver突變是一種普遍現象。為了防止delinver突變體被誤判為純合缺失突變體進而誤導TAG的功能研究，作者建議在TAG敲除突變體的基因型PCR篩選時通過一對同向引物進行第三次（tier-3）PCR，其陰性或陽性PCR產物則可分別反映出該突變體是純合缺失突變體還是delinver突變體。
圖2. 新的PCR鑒定策略能夠區分串聯同源基因的純合敲除突變體與敲除/倒置雙等位突變體。左圖為串聯同源基因（TAG）的CRISPR敲除策略示意圖，圖中展示了成對gRNA的靶點以及基因型鑒定所用PCR引物的靶點。右圖為基因型鑒定PCR的結果與基因型之間的對應關系。四種基因型從左至右依次是野生型、雜合TAG敲除、純化TAG敲除、TAG敲除/倒置雙等位。加號和減號分別代表使用對應PCR引物獲得或未獲得PCR擴增產物。
中山大學博士生劉玖爾和副研究員王鳳珠為該論文的共同第一作者，李劍峰教授為通訊作者。博士生李沖、博士后李雨佳參與了該研究。該研究得到國家重點研發計劃合成生物學專項等經費資助。
